Pylväskromatografia on tekniikka, jota käytetään yhdisteiden erottamiseen ja puhdistamiseen perustuen niiden polaarisuuteen ja vuorovaikutukseen kiinteän ja liikkuvan faasin kanssa. Tässä on vaiheittainen opas pylväskromatografian valmistamiseen ja suorittamiseen:
Tarvittavat materiaalit:
Kolonni: Lasi- tai muovikolonni sulkuhanalla.
Stationaarifaasi: Silikageeli tai alumiinioksidi (adsorbentti).
Liikkuva faasi: Liuotin tai liuotinseos (eluentti).
Näyte: Erotettava seos.
Pakkausmateriaali (valinnainen): Puuvilla tai lasivilla.
Dekantterilasi tai keräyspullot: Eluenttifraktioiden keräämiseen.
Varusteet: Puristin ja teline, pipetti, suppilo, lasta.
Pylväskromatografian valmisteluvaiheet:
Valitse adsorbentti:
Valitse silikageeli tai alumiinioksidi erotettavien yhdisteiden polaarisuuden mukaan.
Adsorbentin hiukkaskoko (40–63 µm) vaikuttaa erotustehokkuuteen.
Valmistele sarake:
Sulje kolonnin pohja puuvilla- tai lasivillalla estääksesi adsorbentin vuotamisen.
Kiinnitä kolonni pystysuoraan telineeseen sulkuhana suljettuna.
Märkäpakkaus (ensisijainen parhaan tuloksen saavuttamiseksi):
Lisää pieni määrä liuotinta (liikkuva faasi) kolonniin.
Valmistele liete adsorptioaineesta liuottimeen (käytä 1.5-2 kertaa kolonnin adsorbenttitilavuus).
Kaada liete varovasti kolonniin suppilon avulla.
Anna adsorbentin laskeutua napauttamalla varovasti kolonnia tai antamalla sen levätä.
Avaa sulkuhana hetkeksi, jotta ylimääräinen liuotin valuu pois, kunnes adsorbentti muodostaa tiiviin ja tasaisen kerroksen.
Kuivapakkaus (vaihtoehtoinen menetelmä):
Lisää kuiva adsorbentti suoraan kolonniin.
Napauta varovasti kolonnia varmistaaksesi tasainen pakkaus.
Lisää liuotinta varovasti kolonnin seiniä pitkin, jotta pakattu adsorbentti ei häiriinny.
Ehdoi sarake:
Kun pylväs on pakattu, esieluoi kolonni liuottimella ilmataskujen poistamiseksi ja adsorbentin tasapainottamiseksi.
Lataa näyte:
Liuota näyte pieneen määrään liikkuvaa faasia.
Levitä näyte varovasti pakatun adsorbentin päälle pipetillä tai ruiskulla.
Anna näytteen adsorboitua stationaarifaasiin.
Lisää mobiilivaihe:
Lisää liuotinta varovasti kolonnin yläosaan häiritsemättä adsorptiokerrosta.
Avaa sulkuhana aloittaaksesi eluoinnin pitäen tasaisena virtausnopeutta.
Kerää murtoluvut:
Kerää eluoitunut liuotin peräkkäisissä fraktioissa koeputkien tai pullojen avulla.
Tarkkaile fraktioita käyttämällä UV-valoa, TLC:tä (ohutkerroskromatografia) tai muita analyyttisiä menetelmiä.
Optimoi liuotinjärjestelmä:
Aloita yhdellä liuottimella tai matalan polaarisella liuottimella.
Lisää polaarisuutta asteittain, jos yhdisteet eivät eluoidu.
Vinkkejä menestykseen:
Vältä ilmakuplia: Varmista, että adsorbenttikerros on pakattu tiiviisti ja tasaisesti.
Säilytä virtausnopeus: Tasainen ja kohtalainen virtausnopeus tarjoaa paremman erotuksen.
Gradienttieluointi: Käytä liuottimien seosta, jonka napaisuus kasvaa asteittain paremman resoluution saavuttamiseksi.
Seuraa edistymistä: Käytä TLC:tä erotuksen tarkistamiseen ja fraktioiden tunnistamiseen.
Seuraamalla näitä vaiheita voit tehokkaasti erottaa ja puhdistaa yhdisteesi pylväskromatografian avulla.